豬瘟（ＣＳＦ）是一種急性熱性傳染病，是zui常見的重要豬病之一。對豬瘟的成功控制主要依賴于疫苗免疫，因此，疫苗免疫效果的優(yōu)劣對豬瘟防控起了決定性作用。豬瘟抗體水平的檢測是疫苗免疫
效果評價的主要方法。本課題組建立了豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ檢測方法，并將其組裝成試劑盒，對試劑盒的批間、批內(nèi)穩(wěn)定性和保存期等進(jìn)行了研究。
一、材料與方法
1)豬瘟抗體間接ＥＬＩＳＡ（簡稱Ｉ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司獨(dú)立實(shí)驗室研制，批號為２０１5０3０５、２０１5０4０７、２０１505０９；豬瘟抗體阻斷ＥＬＩＳＡ（簡稱Ｂ－ＥＬＩＳＡ，下同）試劑盒，豬瘟陽性血清１６份和陰性血清９份，豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）。
2)批內(nèi)穩(wěn)定性試驗:隨機(jī)抽取同一批次試劑盒中的３件，按照說明書對１６份陽性血清和９份陰性血清血清樣本進(jìn)行檢測，比較試劑盒的變異系數(shù)。
3)批間穩(wěn)定性試驗:從３個不同批次試劑盒中隨機(jī)抽取１件，按照說明書對上述１６份陽性血清和９份陰性血清樣本進(jìn)行檢測，比較試劑盒的變異系數(shù)。
4)保存期試驗:隨機(jī)抽取１２件試劑盒置于２℃～８℃環(huán)境中，每隔１個月取出１件對經(jīng)２倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測，直至第9個月。比較不同梯度血清檢測結(jié)果的變化。
5)ＦＶＮＴ 的符合率:田間采集４７４份豬血清，用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒和ＦＶ6)對疫苗免疫豬抗體增長趨勢的檢測:選取７頭豬瘟抗體陰性仔豬，分為免疫組和對照組。免疫組５頭，免疫１頭份豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）；對照組２頭，接種生理鹽水。自免疫后的第１天開始，每隔３ｄ對兩組動物進(jìn)行前腔靜脈采血，直至第２１__天。２１ｄ后定期采血，直至免疫后的第２１３天。分別用豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ 試劑盒和豬瘟抗體Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒進(jìn)行檢測。
二、結(jié)果
1）批內(nèi)穩(wěn)定性試驗：同一批試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)均小于１０％，因此說明，該試劑盒具有較好的批內(nèi)穩(wěn)定性。
2）批間穩(wěn)定性結(jié)果：不同批次反應(yīng)板的變異系數(shù)zui高為１１％，仍在１５％的可接受范圍內(nèi)，說明該試劑盒具有很好的批間穩(wěn)定性。
3）保存期試驗：隨著保存期的延長，梯度稀釋的陽性血清ＩＥ值一直維持在一個穩(wěn)定的范圍內(nèi)，血清效價始終為１２８倍（ＩＥ值≥１０％）。
三、討論
1.豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性：ＥＬＩＳＡ試劑盒的穩(wěn)定性是試劑盒質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。在進(jìn)行試劑盒生產(chǎn)時，應(yīng)嚴(yán)格按照已經(jīng)優(yōu)化的試驗條件進(jìn)行，保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。
2.試劑盒的保存期：保存期是試劑盒質(zhì)量的另一個重要指標(biāo)。影響保存期的因素很多，酶標(biāo)板的熱穩(wěn)定性，酶標(biāo)二抗、對照血清以及稀釋液等均會對zui終的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在進(jìn)行試劑盒研發(fā)時應(yīng)充分考慮上述因素。本試劑盒通過保存期試驗證明，在４℃～８℃下保存9個月，不會影響試劑盒的檢測結(jié)果。為了充分保證試劑盒的有效性，將保存期縮短３個月，即確定試劑盒zui終的保存期為6個月。
3.與ＦＶＮＴ的符合率：雖然豬瘟的診斷方法很多，但是各種技術(shù)均存在不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)，各方法之間的相關(guān)性研究較少。ＦＶＮＴ 作為檢測豬瘟病毒中和抗體的經(jīng)典方法，是貿(mào)易的豬瘟抗體檢測方法。中和作用是特異性結(jié)合，抗體附著在游離抗原表面，阻止其吸附敏感細(xì)胞上，進(jìn)而阻止穿入細(xì)胞復(fù)制。因此，中和試驗是zui直接反應(yīng)血清抗病毒效果的方法。根據(jù)上述結(jié)果，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒與ＦＶＮＴ的符合率可達(dá)９２％，在基層大規(guī)模普查過程中，能夠反映中和抗體水平，為免疫程序的制定和抗體水平的監(jiān)測提供可靠的數(shù)4）對免疫豬血清抗體的動態(tài)監(jiān)測：通過對免疫豬抗體增長趨勢的檢測結(jié)果看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ對抗體由陰轉(zhuǎn)陽的檢出時間為免疫后的１２～１５ｄ，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒檢測表明在免疫后的１５～２８ｄ陸續(xù)由陰性轉(zhuǎn)為陽性。由于Ｉ－ＥＬＩＳＡ 檢測的是針對Ｅ２蛋白的所有抗體，而Ｂ－ＥＬＩＳＡ檢測的是針對Ｅ２蛋白某一個表位的抗體，在免疫初期由于抗體豐度的不同，導(dǎo)致Ｉ－ＥＬＩＳＡ對陽性抗體的檢出要早于Ｂ－ＥＬＩＳＡ。另外，從兩種試劑盒檢測抗體增長趨勢圖中可以看出，豬瘟抗體Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒可以對不同抗體水平的豬血清進(jìn)行有效的區(qū)分，可以從ＩＥ值上直觀的比較兩份血清抗體水平的高低。該試劑盒中所采用的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為反復(fù)免疫的豬瘟抗體強(qiáng)陽性血清，而待檢的免疫血清在免疫后２１３ｄ達(dá)到zui高值時，仍不到陽性對照血清ＯＤ值的８０％。因此說明，Ｉ－ＥＬＩＳＡ試劑盒能夠在更寬的范圍內(nèi)對抗體水平進(jìn)行區(qū)分。而Ｂ－ＥＬＩＳＡ試劑盒采用的是阻斷ＥＬＩＳＡ原理，當(dāng)抗體達(dá)到可以將包被的抗原全部封閉的水平后，就出現(xiàn)了檢測平臺期。因此，阻斷ＥＬＩＳＡ只能在一定范圍內(nèi)對抗體水平的高低進(jìn)行區(qū)分。因此，可根據(jù)種群和生產(chǎn)需要等情況選擇不同的檢測方法。